Поділ клітини

У романах все виходить простіше, ніж у житті. Ось як описує зародження життя на Землі письменник Кілгор Траут, герой «Сніданку для чемпіонів» Курта Воннегута.

Спочатку Творець населив світ роботами. Потім вони йому набридли, і він вирішив зробити істоту, що володіє вільною волею. Сказано — зроблено: з’являється Людина. У її честь Творець закочує бенкет в готелі «Уолдорф Асторія». Під ранок Людину переносять на незайману планету і, поки він відсипається, зішкрябають з її долонь жменю клітин. Клітини висипають в супоподібне море, і починається еволюція. Проходять століття, клітини перетворюються в організми. І всі вони, подібно Людині, володіють вільною волею.

Щодо вільної волі і супообразного моря — не причепишся. З банкетом — куди не йшло, хоча якийсь старомодний генетик міг би висловити сумнів: чи не зашкодить нащадкам? Але зішкрябування з долонь! Абсолютно неправдоподібна деталь. Ні в житті (in vivo), ні в пробірці (in vitro) нічого путнього з таких клітин не вийде. Зішкрябають — це вірно, але не з долонь. З чого зішкрябають — це було перешкодою для цілого покоління біологів, побажали змусити клітину жити повнокровним життям поза рідного організму.

Біологи вже давно з’ясували, що життєві процеси в організмі залежать від поведінки клітин. Чим більше дізнаєшся про клітину, тим більше дізнаєшся про організм. Але як її вивчати? Поки вона входить до складу організму, розгледіти, що в ній відбувається, майже неможливо. А якщо і розгледиш, доведеться довго міркувати, що відбулося з ініціативи самої клітини, а що — за наказом згори. Найкраще ізолювати її від організму і пересадити в штучне середовище. По-перше, клітина все-таки простіше організму. По-друге, на клітини можна впливати і так і сяк, а всі ці дії, так само як і їх наслідки, — контролювати. Що стосується рослинної клітини, то від неї чекали самого цікавого. Німецький ботанік Гебель висловив припущення, що будь-яка рослинна клітина — це в потенціалі ціла рослина. Якщо її вдасться ізолювати і звільнити від підпорядкування організму, всі закладені в ній можливості прокинуться і вона сама зможе перетворитися на організм.

Припущення, коли його перевели на мову генетики, виявилося пророцтвом. З’ясувалося, що клітина зберігає всю спадкову інформацію, властиву її вигляду, і що цю інформацію можна іноді пробуджувати і реалізувати в будь-якому напрямку. Але з’ясувалося це, правда, не відразу, перші клітини, які вдалося змусити жити в пробірці, були клітини тварин. Всі вони виявилися здатні до поділу, але жодна з них, звідки б її не брали, не перетворювалася в організм. Клітини настільки спеціалізувалися, що повернути їм втрачену свободу волі було вже неможливо.

З рослинними клітинами довелося повозитися: взяті від рослини без розбору, вони спочатку не бажали навіть ділитися. Але це не збентежило дослідників. Вони вирішили продовжити досліди з меристемою — тканиною на кінчику кореня і в нирці майбутнього паростка. Вона-то вже спеціально призначена для ділення і зростання. І ось перший успіх: взяті від клітини меристеми стали жити в пробірці.

Це було в 1922 році. А років через десять знайшли більш зручну для експериментів тканину — паренхіму, з якої складаються бульби, м’ясисті корені, плоди і стебла рослини. Шматочки будь-якої тканини, будь то меристема або паренхіма, поміщені в пробірку, перетворювалися через тиждень в каллус. Каллус, що в перекладі з латині означає мозоль, — це наплив, що росте там, де рослині завдали якусь рану.

Можливості цієї пухкої маси, що росте не по днях, а по годинах, виявилися воістину безмежні, бо клітини або її втратили, або ще не набули спеціалізацію. Щоб зберегти калюсні клітини, частину їх треба час від часу пересаджувати на свіже середовище. Заняття це трохи дратує експериментаторів, але все окупається надихаючим результатом: культура тканини може жити рівно стільки, скільки буде існувати наука фізіологія рослин. Французький дослідник Готре виростив з тканини морквини штам калюсних клітин. Клітини цього штаму благополучно живуть у багатьох лабораторіях світу; вони так само свіжі і так само помаранчеві, як і в дитинстві. Зауважимо принагідно, що зараз для отримання калюсної тканини вже не обов’язково наносити тілесні ушкодження клітинам: досить подіяти на будь-яку клітину гормонами в особливій комбінації, і вона перетвориться в калюсну.

Дещо вони все-таки пам’ятають

Втрата спеціалізації при перенесенні клітин в пробірку означає, що її генетичний апарат зазнав грандіозний струс, а сама клітина почала абсолютно нове життя. Справді, уявіть собі клітину, яка належала колись листу. В ті часи весь її апарат був налаштований головним чином на фотосинтез: гени, що знаходяться в ядрі і відповідальні за фотосинтез, працювали активніше за інших. Але ось клітина опинилася в пробірці. Тепер гени фотосинтезу зійдуть зі сцени і поступляться місцем генам, що відповідають за розмноження. Слідом за цією зміною змінюється і весь спектр структурних і ферментних білків.

Як з’ясувалося, цими змінами керують гормони. Їх і вводять в середовище, щоб отримати каллюсну масу і підтримати її зростання. Причому важлива не тільки кількість гормонів, але і співвідношення їх у живильному середовищі. Спробуємо розібратися в тому, що відбувається.

Співробітниця лабораторії культури тканин і морфогенезу Н. Н. Дмитрієва розповідає про проведений нею експеримент:
— Я взяла у стебла тютюну шматочок тканини, помістила його на живильне середовище і стала діяти на клітини рослинними гормонами — ауксином і цитокініном. Завдання було в тому, щоб зрозуміти, яку роль відіграє ауксин, а яку — цитокінін. Тому довелося вводити в середовище і обидва гормони разом, та кожен окремо.

З’ясувалося, що в грі вони повинні брати участь обоє, але призначення їх різне і вступають в гру вони по черзі. Ауксин готує клітину до поділу. Під його впливом розпушується оболонка клітини, збільшується число тих клітинних органел, які готують поділ, і, нарешті, відбувається основна подія — реплікація ДНК. Але якщо в середовищі немає цитокініна, на цьому все і закінчується. Клітина буде рости, але не ухвалить «рішення» ділитися. Щоб змусити її ділитися, необхідний цитокінін. Він як би включає підготовлений ауксином поділ.

Такий механізм подвійного гормонального контролю за поділом клітин. Як гормони діють на генний апарат — поки ще точно невідомо. Це область непізнаного — гіпотез і здогадів.

Всі калюсні клітини схожі одна на одну, і розрізняють їх не по виду, а з ярличків. Схожі і деякі біохімічні характеристики. Як біологи встановили, що у клітин, отриманих, наприклад, з насіння льону, з тканин стебла тютюну, однаково збільшується частка насичених жирних кислот, що як раз і властиво одноклітинним організмам. Весь обмін речовин у цих клітинах, спрямований на підтримання їх розмноження і зростання, набуває архаїчні риси. Загальні риси знайдені і живучі в суспензії клітин явора і клітин дріжджів.

Цікава подробиця: у процесі втрати клітиною своєї «професії» серед нових білків у ній з’являється білок, дуже схожий на один з білків вже знайомої нам меристеми. Це може означати тільки одне: активізацію структурного гена, який перебував у пригніченому стані, коли клітина набувала спеціалізацію.

Звичайно калюсні клітини майже безбарвні. Але серед цих пухких блідо-кремових грудочок вам раптом впадає в очі яскраво-зелена пляма. Що це? Теж калюсна тканина — від ялини. І не від голок, а від кореня. Ось він, доказ збереження генетичного потенціалу! Впливаючи на клітину кореня особливою комбінацією гормонів, експериментатор активізував ті самі гени, які відповідальні за фотосинтез. Всупереч всім перетворенням калюсні клітини все ж не розлучаються зі своїм минулим. У них вигадливо поєднуються властивості тканин, з яких вони були вилучені, ознаки виду і нові особливості, пов’язані з існуванням вже на новому рівні — поза організмом.

Генетичною пам’яттю можна скористатися в практичних цілях. Наприклад, зберегти у клітинних культурах спадковий потенціал багатьох рідкісних або приречених на вимирання рослин. Або біосинтетичний потенціал: клітини синтезують не тільки те, що потрібно їм самим, але і так звані речовини вторинного обміну, які потрібні цілій рослині і якими вона давно ділиться з людиною. Це — алкалоїди, глікозиди, фенольні сполуки, ефірні олії, смоли, стероїди, інгібітори. Виробляючи ці цінні речовини, клітини виділяють їх у живильне середовище. Бери і користуйся!

Найчастіше клітини, що живуть в пробірці, не в змозі накопичити цих речовин стільки, скільки збирається їх в запасаючих органах рослини. Але, по-перше, «вихід» цих речовин можна збільшити, діючи на клітини мутагенами і отримуючи більш продуктивні мутанти, а, по-друге, клітини розмножуються так швидко, що шкодувати про їх невисоку продуктивність навіть не доводиться. Особливо якщо мова йде про рідкісні види, наприклад про раувольфію зміїну — єдине джерелі резерпіну, про діоскорею, що поставляє нам стероїди, або про знаменитий женьшень. До речі, клітини женьшеню — щасливий виняток з правила: дорогоцінних тонізуючих речовин вони містять не менше, ніж сам корінь. У природних умовах корінь женьшеню додає тільки по граму у рік. А клітини за три тижні утворюють солідну масу — 400 грамів на літр середовища. Схоже на те, що романтичній професії шукачів женьшеню може прийти кінець.

Мені показали дві корзини садової суниці одного і того ж сорту. У першій — ягоди великі, в іншій — дрібні, миршаві. У чому ж справа? Пояснення досить просте. В першій корзині ягоди зі здорових кущів, а у другій — суниця, уражена вірусом.

Особливо небезпечні віруси для культур, що розмножуються відводками, живцями і бульбами: разом з посадковим матеріалом вірус переходить з покоління в покоління. Боротьба з цією недугою ускладнюється тим, що живе вірус в самій клітині рослини. Знищиш вірус — погубиш і саму клітину.

Втім, вчені помітили, що віруси оминають стороною верхівкову меристему — точку росту у верхівці рослини. І ось маленький шматочок меристеми поміщають в рідке середовище, з шматочка виходить безформна маса, а з маси виростають бруньки, сотні бруньок. Бруньки розвивають пагони, пагони укорінюються і лабораторія перетворюється на чарівний розплідник крихітних орхідей. Як стверджують французькі дослідники, з одного стебла орхідеї можна отримати за рік майже два мільйони цих вибагливих рослин. У такої орхідеї вірусів немає.

Цитоняня

Як правило, дослідник прагне до того, щоб вирощувана їм популяція клітин була генетично однорідною. А цього можна домогтися, якщо вирощувати культуру не з шматочка тканини, а з окремої клітини. Здавалося б, чого простіше! Однак з’ясувалося, що клітина тяжіє до суспільства і погоджується ділитися лише в тому випадку, якщо неподалік від неї будуть інші клітини. Словом, на одиницю поверхні середовища має припадати певна кількість «жителів», а між ними — існувати якийсь зв’язок. Чи не виділяє клітини в середовище яка-небудь речовина, що спонукає сусідів до поділу?

Американський дослідник Хільдебрандт виловлював клітини із суспензії і кожну висаджував на середовище окремо. Клітини не ділилися. Тоді він помістив їх на шматочок фільтрувального паперу, який стикався з групою швидко розмножувальних клітин того ж виду. Клітини почали ділитися. Коли з них вийшли маленькі колонії, їх перенесли на агар. Популяція, яка змусила клітини ділитися, надихнула назву тканини – няньки.

Але як же вона їх все-таки змусила? За останні роки стільки було розмов про те, як клітини обмінюються інформацією, що залишити питання відкритим було просто непристойно. Між клітиною і нянькою стали споруджувати різні перешкоди. Скло обірвало всю сигналізацію. Напівпроникна плівка сповільнила перехід до поділу. Промокашка — не перешкода! Отже, хімічна речовина. Судячи по дії перешкод, це поліпептид, або білок з низькою молекулярною вагою. Але навіщо він потрібен клітині? Може бути, він грає роль гормону, що спонукає до поділу?

Такий ж хімічний зв’язок-сигналізація допомагає клітинній популяції відновлювати порушену рівновагу. Якщо піддати її впливу гамма-променів, причому подіяти ними тільки на ті клітини, які вже діляться або збираються ділитися, число поділок різко скоротиться, але потім так само різко зросте. Плодитися почнуть тепер ті члени компанії, що до опромінення зовсім не були до цього схильні. Невідомим ще, але, безсумнівно, хімічним шляхом заражені клітини повідомили здоровим: «Нас вивели з ладу, замінюйте нас!».

Нове життя

Розповідаючи про життя клітин, ми часто згадували про гормони. Їм належить головна регулююча роль в житті клітин, як, втім, і в житті цілої рослини; без них не буде ділитися ні клітина, яка потребує няньки, ні сама нянька.

А чи не можна використовувати гормони не тільки для регулювання поділу, але і для більш серйозних перебудов в клітинних популяціях? Клітина, що живе в пробірці, вже не належить своєму органу-предку: гени, що змушували її працювати на цей орган, вимкнені. Але вони продовжують існувати, як існують взагалі всі її гени. Чому б не повернути їх за допомогою тих же гормонів до колишніх обов’язків і перетворити групу клітин в орган — корінь, стебло, лист, нирку?

Серед перших спроб створити з неспеціалізованої тканини орган рослини, тобто викликати штучний морфогенез, повчальний експеримент, що належить професору Гарвардського університету Вэтмору. В його лабораторії вирішили сконструювати з клітинної культури провідну систему рослини. По цій системі з кореня в стебло рухаються поживні речовини, а з листя — продукти фотосинтезу. Складається вона з судин, призначених для перекачування води та солей (ксилема), і з ситовидних трубок, по яким рухаються органічні речовини (флоема). Вэтмор припустив, що перетворенням клітин в елементи ксилеми і флоеми командують гормони, що виробляються меристемою. У масі калюсних клітин зробили v-подібний виріз і вставили в нього верхівкову бруньку з зачатками листків. Брунька залишилася жити, а клітини під вирізом стали перетворюватись в елементи провідної системи.

Припущення щодо гормонів меристеми підтвердилося. Тепер можна було спробувати замінити бруньку активними речовинами, що виробляються клітинами меристеми. Речовини діяли неоднаково. Коли у виріз вводили вже знайомий нам гормон ауксин з сахарозою високої концентрації, з калюсних клітин виходили елементи флоеми, а коли з сахарозою низької концентрації — ксилеми.

Коли дослідники перейшли від провідної системи до конструювання стебел та коренів, виявилася ще одна закономірність. Якщо зміст гормонів, що вводяться в середовище більш або менш збалансований, калюсна тканина росте не диференціюючись. А якщо зрушити цей баланс в сторону, чекай диференціювання. Переважає в середовищі ауксин — утворюється корінь; переважає цитокінін — стебло. Змінюючи співвідношення гормонів, морфогенез можна направити в будь-яку сторону. Можна зробити і так, щоб калюсна клітина дала початок не органу, а зародку цілої рослини.

Іншими словами, її перетворюють в таку клітину, яка функціонально подібно заплідненої яйцеклітини — зиготі, хоч і виходить від ділення не на статевих, а соматичних клітин. Тому подібний ембріогенез іменується соматичним.

Список питань, які займають дослідників, незмірно більше списку отриманих відповідей. Коли завідувач лабораторії культури тканин і морфогенезу Р. Р. Бутенко розповідає про свої досліди або про досліди своїх колег, вона не втомлюється повторювати: «Поки нам краще вдається контролювати морфогенез, ніж пояснювати його. Більшість пояснень — гіпотези. Область непізнаного тут значно перевершує ту дещицю, що вже відомо».

Природно, йде пошук. Пошук таких підходів, що допомогли б подолати прірву між тими подіями у клітині, які описуються в термінах молекулярної біології та змінами, які відбуваються з нею як з самостійним організмом або елементом якогось цілого.. Ця прірва буде існувати до тих пір, поки не стануть ясними зв’язки між різноманітними елементарними процесами, від яких залежить поява органів рослини. Подолати ж її дуже важливо, так як саме тут приватна проблема вирощування ізольованих рослинних тканин поєднується з основним питанням сучасної біології — питанням про те, як виникло розмаїття живого.

Раїса Георгіївна вважає одним з найбільш багатообіцяючих напрямків пошуку, виявлення та дослідження рослин-мутантів — таких «калік», які б мали поломки, що перешкоджають процесу утворення органів на різних його стадіях. Будучи організмами, вони зазвичай не виживають, у культурі ж in vitro можуть існувати як завгодно довго.

Ось перед нами ряд пробірок з такими «каліками». Це — рослини тютюну. Втім, рослинами, їх можна назвати умовно: в одних немає стебла, в інших — кореня, у третіх — листя. Якщо висіяти клітини від цих рослин і отримати різні культури, у кожній з яких зберігався б один характерний блок-поломка, то дослідник, маючи справу з такою цитотекою невдач природи, отримає матеріал, що допомагає йому розібратися у біохімічних причинах цих невдач і знайти критичні моменти, ключові точки в нормальному процесі морфогенезу.

І знову питання. Яка в кожному конкретному випадку причина відхилень, що спостерігаються у цих рослинах ? Що це, поломка генетичного апарату або стійке ре пресування відповідальних за морфогенез генів, яке просто не вдається зняти?
Або те ж саме питання в дещо іншому варіанті: чому клітини, довго живуть в пробірці, а потім втрачають здатність до морфогенезу?

Щоб знайти відповіді на ці питання, схрещують клітини із штаму, який втратив здатність до морфогенезу, з клітинами, узятими з рослини, здатного до цього процесу. Підбираючи штами з цитотеки «виродків», у яких по-різному і на різних стадіях зламана або заблокована здатність до органотворення, можна спробувати змусити клітину розповідати про рушійні сили в ній на всіх етапах її перетворення.

Але чи можна схрещувати клітку за кліткою, та ще таким хитромудрим способом? Можна, якщо мати справу з протопластами — «роздягненими» клітинами. Раїса Георгіївна вважає ізольовані протопласти одним з найбільш цікавих і перспективних методів досліджень, причому як з теоретичної, так і з практичної точки зору. Як ми зараз переконаємося, що це дійсно так.

Руйнування дерев’яної в’язниці

На відміну від тваринної клітини рослинна укладена в міцну целюлозно-пектинову оболонку, «дерев’яну в’язницю», як назвав її один дослідник. У сусідів по тканині ці оболонки пов’язані одні з одними, і самі клітини, таким чином, міцно скріплені між собою. Ось чому їх так важко «зіскоблювати». Зруйнувати «в’язницю» можна кислотою, але разом з нею тоді загине клітина. Спосіб, при якому «в’язниця» руйнується, а «арештант», іменований протопластом, тобто клітиною без оболонки, виходить на свободу цілим і неушкодженим, придумав англієць Кокінг.

Клітини обробляють сумішшю двох ферментів: один з них руйнує пектинові речовини, а інший — целюлозу. Ці ферменти виділяються мікроорганізмами, наприклад пліснявою, яка виросла на хлібі. Багатий ними і шлунковий сік виноградного равлика, що живиться листям лози.

Звільнення з дерев’яної в’язниці пов’язано з великими клопотами. Треба знайти відповідну концентрацію ферментів, додати до них речовини, які викликали б зневоднення клітини: протопласт повинен стиснутися в грудку, щоб зруйновані стіни не зачепили його. Потім протопласт треба відмити від ферменту і особливими речовинами зрівняти внутрішній і зовнішній тиск, інакше його тонка мембрана розірветься. Все це віддалено нагадує клопоти з водолазом, якого піднімають з великої глибини на поверхню.

Але тягар свободи не по силам колишньому «арештантові». Ледве потрапивши на живильне середовище, протопласт прагне знову перетворитися в клітку. Через три дні він знову вибудовує навколо себе «дерев’яну в’язницю», таку ж міцну, як і колишня, а через два тижні перед нами вже не одна, а ціла колонія клітин.

Однак у розпорядженні експериментатора є своєрідне вікно у часі — ці самі три дні, коли він має прямий доступ до клітки і може втручатися в її інтимне життя.

Проробляти подібні операції вдається, звичайно, не з усіма рослинами. Найкраще це виходить у різних сортів тютюну і його родичів. Клітини цього роду взагалі легко переселяються в пробірку і перетворюються у все, чого від них вимагатимуть. Інші рослини чинять опір такому насильству. Досі ні від злакових, ні від бобових протопластів не вдалося отримати цілої рослини. А фізіологи, які займаються протопластами, як раз хочуть вирощувати з них і пшеницю, і жито, а ще ячмінь, горох, сою… Тому, що тут мова йде про можливість виведення таких гібридів, про яких селекціонери не могли і мріяти.

Автор: Н. Федотова.