Зонд для клетки

Клеточная теория утверждает, что все живые существа — растения, животные, простейшие организмы — состоят из клеток и их производных, что клетка — основная структурная и функциональная единица жизни. От успехов в изучении клетки зависит решение многих проблем биологии, медицины и сельского хозяйства. Вот почему много поколений ученых так настойчиво исследуют строение и поведение клеток.

Живая клетка

Как известно, тульский оружейник Левша подковал механическую блоху, работая без «мелкоскопа». У него был «глаз пристрелявши». Живая клетка, о которой пойдет речь, по объему примерно в миллион раз меньше блохи. При хирургическом оперировании такой клетки приходится выполнять столь мелкую работу, что обойтись без специальной аппаратуры невозможно. Клетка сама имеет микроскопические размеры, а размеры ее органоидов лежат у пределов или за пределами разрешающей способности самых лучших световых микроскопов. Естественно, что успехи тех, кто изучает клетку и ее удивительную внутреннюю организацию, зависят от совершенства методики и исследовательской аппаратуры, от прогресса в этой области.

На протяжении столетий, с тех пор, как в 1665 году Роберт Гук, усовершенствовав микроскоп, рассмотрел в него клеточное строение среза, сделанного с простой пробки, этот прибор был основным и едва ли не единственным инструментом при изучении клетки. Наука о клетке долго оставалась преимущественно описательной. Ученые старательно собирали сведения о микроскопическом строении самых разных клеток, изучая препараты мертвых и окрашенных специальными красителями тканей. В этих работах классики микроскопических исследований достигли поразительных успехов. Однако нельзя достаточно глубоко понять явления жизни, оставаясь лишь сторонним наблюдателем. Необходим эксперимент, и в частности хирургический, точнее, микрохирургический эксперимент с живой, функционирующей клеткой.

До 30-х годов прошлого века такие эксперименты проводились лишь в единичных случаях, вручную и в основном только с такими крупными клетками, как, например, яйца лягушки. Лишь в 30-х годах ХХ века были созданы первые специализированные механические приборы для микроопераций на клетках — микроманипуляторы. Эти первые приборы были оснащены микроскопом для наблюдения за ходом операции и набором инструментов, крючочков, иголочек, микропипеток, микроэлектродов и т. п. для микроизмерений, микроинъекций, микропересадок или для рассечения, разрушения или извлечения отдельных внутриклеточных структур.

Механические микроманипуляторы помогли, да и помогают сейчас, исследователям собрать много ценных сведений о клетке и ее содержимом. Чаще всего с этими приборами оперируют крупные клетки — икринки, амебы или, например, гигантские одноклеточные водоросли. Однако удается их использовать и для изучения обычных клеток многоклеточного организма. Для этой цели их чаще всего выделяют из организма и выращивают (культивируют) в стеклянном сосуде с питательной средой. Клетки, осевшие на дно такого сосуда, прикрепившиеся к стеклу и распластавшиеся на его поверхности, удобно рассматривать снизу с помощью перевернутого (инвертированного) микроскопа. Наблюдателю доступны в таком случае мельчайшие их структуры. Неподвижную и распластанную клетку удобно оперировать, а затем можно в течение многих дней следить за результатами операции. Изменяя состав питательной среды и вводя в нее различные химические препараты, можно изучать течение послеоперационных процессов в различных экспериментальных условиях. В любой момент оперированную клетку можно убить фиксирующей жидкостью и исследовать ее состояние с помощью любого из хорошо известных методов, предназначенных для таких случаев.

Для точного проведения эксперимента оператор должен видеть оперируемую клеточную структуру. Что ж, однако, можно увидеть в микроскопе? Ведь содержимое клетки обычно прозрачно в видимом свете. При обычном освещении иногда трудно даже различить очертания клетки. Однако существуют различные виды специального освещения. Вот, например, микрофотографии делящейся культивируемой клетки кенгуровой крысы. Такой мы видим ее при фазовоконтрастном микроскопическом освещении, с помощью которого удается оттенять отдельные плотные структуры даже в совершенно прозрачном объекте.

На микрофотографиях клетка показана в разных стадиях ее жизненного цикла, то есть на протяжении всей ее жизни, завершающейся делением. Как метко было отмечено, благодаря делению клеток жизнь ухитряется обвести вокруг пальца время!

В результате этого удивительного процесса вместо одной постаревшей клетки возникают две молодых с новым запасом жизненных сил. Значение клеточного деления настолько понятно, что нет необходимости его разъяснять. Достаточно напомнить только, что клеточное деление обязательно для самого существования и развития всех живых систем, а его нарушения приводят к самым мрачным результатам. Ход событий при нормальном и патологическом размножении клеток давно уже тема номер один в исследованиях медиков и биологов всех специальностей, однако до сих пор механизм деления, механизм его регуляции остаются во многом непонятными.

Клеточное деление исследовалось и исследуется с помощью разных методических приемов. Естественно, что пытались исследовать это явление и с помощью микроманипулятора. Однако самый тонкий механический инструмент оказывается довольно грубым в сравнении с мельчайшими структурами клеток. При любой механической микрооперации приходится прорывать клеточную, а иногда и ядерную оболочку, и, прежде чем удается добраться до изучаемой внутриклеточной структуры иглами и крючками, клетке наносятся губительные повреждения. Работа с микроманипулятором трудоемка и требует высокого искусства экспериментатора. Однако даже самый искусный коллега лесковского Левши вряд ли сможет с помощью крючка или иглы быстро и аккуратно повредить определенный химический компонент в определенном участке хромосомы, двигающейся в живой делящейся клетке. Для решения подобных экспериментальных задач нужен совершенно иной методический прием.

Луч света

В 1908 году в Мессине, на севере Сицилии, произошло землетрясение. Сергей Степанович Чахотин, работавший в то время на Средиземноморской биологической станции, получил тяжелые повреждения позвоночника. Он неподвижно лежал в затемненной больничной палате и, как полагается настоящему ученому, размышлял об… «идеях немецкого патолога Рудольфа Вирхова о клетке и французского физиолога Клода Бернара о значении эксперимента в биологии…» По его воспоминаниям, сквозь темную штору в палату проникал узкий луч солнечного света, высвечивавший в воздухе отдельные пылинки. Вот этот-то луч и навел Чахотина на мысль о создании оригинального прибора для исследования клетки. Идея состояла в том, чтобы использовать тончайший пучок световых лучей, который бы проникал сквозь клеточную оболочку и фокусировался в световое пятно на любой внутриклеточной органелле.

Таким «лучевым скальпелем», «световым микроуколом» Чахотин предложил выжигать, разрушать или инактивировать отдельные клеточные структуры. Эта идея настолько проста и естественна, что она, например, независимо, при сходных обстоятельствах возникла и у автора этих строк, но с опозданием на пятьдесят лет.

Однако содержимое клетки обычно прозрачно, и видимый свет легко проходит сквозь клетку, не вызывая серьезных повреждений. Иное дело ультрафиолетовый свет, невидимый глазу. Это излучение эффективно воздействует на наиболее важные биологические макромолекулы, и, что очень важно, действие света зависит от длины его волны. При одной длине волны можно избирательно воздействовать на нуклеиновые кислоты хромосом, а при другой — преимущественно повреждать белки. Следовательно, появляется возможность как угодно хозяйничать на нужном участке клетки, по желанию разрушая отдельные химические компоненты.

Сергей Степанович осуществил свою идею и создал первый прибор для микрооблучения, назвав его микролучом. Он открыл новую область исследований — микрофотохирургию и выполнил десятки интересных исследований.

В 60-х годах прошлого века, когда началось особенно бурное развитие биологии, и в частности молекулярной биологии, когда выяснилось, что решение важнейших вопросов биологии надо искать на клеточном уровне, и когда перед исследователями остро встали проблемы действия на живые организмы радиации различных видов, интерес к методу микрооблучения резко возрос. Во многих лабораториях мира появились микролучевые установки. В США был использован протонный микролуч, дающий тончайший пучок быстрых протонов, разогнанных в мощной ускорительной установке. Появился микролуч электронов. Во Франции, а позднее и в США были созданы прецизионные лазерные микролучевые установки. Впрочем, и по сей день микролучевые работы ведутся в Англии и Японии.

Разнообразие аппаратуры в данном случае вызвано тем, что микролучевой эксперимент интересен сразу с двух точек зрения. Радиобиолога или фотобиолога (есть такая специальность) в первую очередь интересуют механизмы действия излучения. Для них интересны тонкости воздействия лучей разной природы на живой объект — радиобиологи используют главным образом ионизирующие излучения. Правда, любой радиобиологический эксперимент всегда имеет и общебиологическое значение.

Для биолога же, изучающего клетку, микролуч — это только инструмент. Для этой цели наиболее удобны традиционные ультрафиолетовые микролучи или микролучи мощного лазерного видимого света. Большая часть результатов, представляющих интерес для биологии, получена именно с такой аппаратурой.

Как же работает микролуч? Ультрафиолетовый микролуч совмещен с обычным инвертированным микроскопом, предназначенным для рассматривания предметов снизу. Объектом наблюдения обычно является культивируемая клетка млекопитающих, распластавшаяся на ровной поверхности тонкого кварцевого стекла, вмонтированного в донном отверстии сосуда с питательной средой. Наблюдения ведется с помощью кварцевого объектива, пропускающего как обычный, так и ультрафиолетовый свет.

На такой установке по любой клеточной структуре, различимой в световом микроскопе, можно нанести направленный лучевой удар. К настоящему времени облучено, вероятно, все, что можно различить в живой клетке. Нанести «лучевой удар» стало относительно несложно. Значительно труднее ныне определить цель «удара», то есть поставить задачу исследования. Трудно корректно провести эксперимент, найти способ выявления последствий лучевого удара (работая с одной клеткой!), непросто сделать выводы и, вероятно, еще сложнее сделать правильные выводы. Для успеха необходимо, конечно, сочетать метод микрооблучения с другими современными методами исследования: электронной микроскопией, радиоавтографией, замедленной микрокиносъемкой и т. п. И чего же все-таки можно добиться с помощью микролуча? Вот несколько экспериментов

Ядро или цитоплазма?

Мы остановились на одной из «подпроблем» большой и сложной проблемы — ядерно-цитоплазматических взаимоотношений: на том, как они складываются при действии на клетку радиации.

В чем причины интереса к этому? Как полагают, само зарождение жизни на Земле связано с действием ультрафиолетовой радиации, игравшей, по-видимому, не последнюю роль в синтезе первых биомолекул. Нет сомнения и в том, что излучения как мощный мутагенный фактор и фактор внешней среды сыграли существенную роль в эволюции жизни на протяжении миллионов лет. Существование биосферы полностью зависит от потоков солнечной радиации.

Однако далеко не всякое действие радиации полезно. Вредными оказываются даже длительные солнечные ванны, а для многих микроорганизмов солнечный свет губителен. Вредное действие ионизирующих излучений человечество осознало сразу после их открытия, сто двадцать лет назад. В наш атомный и лазерный век проблемы поражающего действия излучений различной природы особенно актуальны. Кстати, еще и потому, что оно теперь широко используется в медицинской и исследовательской практике.

В принципе излучением любого вида при достаточной его интенсивности можно убить любой организм, нарушить любой биохимический процесс и разрушить любую биомолекулу. Однако одни ткани и органы обычно чувствительнее других. Уже давно доказано, что наиболее чувствительными к радиации оказываются ткани с размножающимися клетками, а наиболее уязвим в этом отношении процесс клеточного размножения. (Этот факт используется в медицине при лечении онкологических заболеваний для подавления неконтролируемого размножения клеток.) Причины чрезвычайной чувствительности делящихся клеток еще не выяснены. По-видимому, излучение нарушает тонкие процессы регуляции клеточного деления. Однако к настоящему времени сами процессы этой регуляции во многом не изучены, естественно, что и о причинах их нарушений можно высказывать только догадки.

До сих пор остается спорным даже вопрос о том, что является самой уязвимой и главной мишенью первичного лучевого поражения,— ядро или цитоплазма. Еще в 1947 году в экспериментах с тутовым шелкопрядом академик Б. Л. Астауров продемонстрировал, какое исключительное значение имеет радиационное повреждение хромосом ядра. Однако есть также множество фактов, показывающих, что и облучение цитоплазмы иногда губительно для всей клетки. Например, может повреждаться клеточная оболочка, от состояния которой зависит обмен клетки с внешней средой; по данным последних исследований, эта оболочка играет существенную роль и в регуляции клеточного деления.

В облученной цитоплазме появляются яды и освобождаются ферменты, отравляющие и разрушающие клетку. Облучение может нарушить работу и энергетического аппарата клетки, находящегося в цитоплазме. В цитоплазме «помещаются» и стройдетали «веретена» — аппарата, обеспечивающего деление клетки. Исследователям удалось, кстати, убедиться, что микрооблучение даже небольшого участка цитоплазмы губительно действует на этот аппарат. Видимо, оно способно разрушать жизненно важные элементы, как ядра, так и цитоплазмы.

А может быть, ядрышко?

В 1781 году Феликс Фонтана писал: «Посмотреть в микроскоп может каждый, но лишь немногие могут судить о виденном». Это замечание не потеряло актуальности и в наши дни. 200 лет тому назад Фонтана увидел и зарисовал ядра клеток, а в ядрах — ядрышки. Однако оценить значение этих структур он, конечно, не мог.

Посмотрите на первую из уже упоминавшихся фотографий клетки кенгуровой крысы и вы увидите, что ядрышки являются наиболее заметными клеточными органеллами. Уже к началу прошлого века ядрышку было посвящено около тысячи научных исследований. Оно интересовало как биологов, так и медиков. Было подмечено, что ядрышки особенно велики в клетках с интенсивным синтезом белка, и в частности в быстроразмножающихся клетках. Тем не менее, значение ядрышка оставалось непонятным, и его долго еще называли «самой мистической органеллой» клетки.

Лишь относительно недавно в связи с успехами молекулярной биологии была выяснена основная функция ядрышка. Теперь мы знаем, что ядрышко — это место синтеза рибосомальной РНК и его деятельность тесно связана со снабжением клетки многочисленными рибосомами, мельчайшими универсальными «машинами» для синтеза белка. Весь синтез белка в клетке осуществляется ими по программам, доставляемым из ядра информационной РНК. Создание рибосом начинается в ядрышке, и лишь позднее, после сложного процесса созревания, эти органеллы оказываются в цитоплазме и приступают к работе.

Одно из первых и основных доказательств участия ядрышка в синтезе цитоплазматических рибосом было получено путем нарушения его деятельности микролучом. Эти эксперименты — одно из основных достижений техники микрооблучения. Но, по-видимому, до сих пор раскрыты еще не все стороны деятельности ядрышка, а в его поведении многое еще остается загадочным. Перед каждым клеточным делением ядрышко быстро и таинственно исчезает. От него обычно в течение нескольких минут не остается и следа, но как раз в это время в клетке появляются плотные тела митотических хромосом. После деления хромосомы быстро исчезают из вида, но в новых ядрах появляются и зреют новые ядрышки. В чем причины исчезновения ядрышек? Каковы механизмы и значение этого процесса? Какова судьба вещества исчезающих ядрышек, из чего и как строятся новые ядрышки? — вот часть вопросов, для решения которых были использованы разнообразные методы исследования, в том числе и метод микрооблучения.

Классическими методами было установлено, что ядрышки образуются только около некоторых определенных участков хромосом — у так называемых ядрышковых организаторов. Число этих организаторов в клетке невелико и определенно. Длина организатора составляет лишь десятые доли микрона. Недавно Бернсу в США удалось с помощью тончайшего лазерного микролуча облучить не только ядрышковый организатор, но даже и его отдельные участки. Этот необычайно тонкий эксперимент подтвердил значение организатора для формирования ядрышка. По сути дела, в этом эксперименте была осуществлена направленная мутация, с помощью микролуча была нарушена работа определенной группы генов в определенной хромосоме.

Автор: В. Сахаров, кандидат физико-математических наук.