Загадка ферментной индукции

В самом конце позапрошлого века француз Е. Дюкло описал явление, ставшее «камнем преткновения» на целые 60 лет. Явление, впоследствии названное «ферментной индукцией», упорно мешало продвижению вперед многих исследований. Коротко говоря, сводилось оно к следующему. Возьмем клетку, которая способна синтезировать, то есть из двадцати, примерно, аминокислот-блоков строить сложные цепи белковых молекул, например фермента А. Экспериментатор, исследуя эту клетку, видел, что в один какой-то момент белок А в ней не синтезировался. На втором этапе опыта в клетку вводилось вещество: оно либо расщеплялось ферментом (то есть было субстратом его), либо было ему родственно (тогда его называют индуктором). В ответ клетка начинала деловито вырабатывать фермент А. Как только вещество убиралось, синтез фермента приостанавливался. Вот и все.

Эксперимент повторяли в десятках лабораторий, но положение от этого не становилось лучше. Почему? Потому что он противоречил общим представлениям о белковом синтезе. Считалось: в ядре, в хромосомах, состоящих из белка и нуклеиновых кислот, содержится информация — сведения о белках, которые клетка способна строить сама, и о составе этих белков. От хромосом эта информация передается в цитоплазму (тело клетки), где и происходит синтез белка. (Теперь-то мы уже знаем, что информация записана в длинных нитях нуклеиновых кислот чередованием четырех веществ — азотистых оснований. Известно и то, как идет синтез белка: на ДНК хромосомы строятся ее зеркальные копии — молекулы-посредники, которые из ядра проникают в цитоплазму и входят в рибосомы. Тут-то А складываются из аминокислотных блоков белковые молекулы. Строение белка определяется строением молекулы-посредника, вошедшей в рибосому. Но все это было изучено совсем недавно, а прежде оставалось неизвестным.)

Наконец, последнее. Хромосомы разделены на самостоятельные отрезки — гены. Каждый такой отрезок управляет синтезом одного белка-фермента. Это обстоятельство легло в основу формулы американских ученых Бидла и Тэтума «один ген — один фермент». Ферменты — особые белки — управляют всеми реакциями в организме, в тысячи раз ускоряя их течение.

Но вернемся к нашему примеру. Клетка сначала не синтезировала фермент А. Почему? Значит, в ней нет и гена А? Вспомните: один ген — один фермент. Потом по команде индуктора или субстрата синтез начинался. Что же, индуктор образовывал новый ген в хромосомах? Но это уже было бы чистой мистикой! Тем более, что таинственные превращения на этом не кончались: если в клетку добавлялось небольшое количество индуктора, то в скором времени синтез белка прекращался. Значит, когда иссякал запас индуктора,— ген снова исчезал?!

Сначала список ферментов, поддавшихся такой индукции, был довольно скромным, но по мере расширения биохимических исследований, он начал угрожающе разрастаться. Конечно, в момент открытия ферментной индукции Дюкло ничего не знал о генах. Но со временем утверждение: если в клетке вырабатываются ферменты, то в ней должны быть и гены, дающие информацию о синтезе этих ферментов, — стало серьезно беспокоить ученых. Повторяю, считалось, если уж наследственность налицо, то и деваться некуда: ген непременно сработает.

Но у фактов была своя логика. Коротко ее можно было бы изложить так: индуктора нет — индуктор есть — индуктора нет. И параллельно: синтеза нет — синтез есть — синтеза нет. Эта логика не оставляла ничего другого, как предположить: какие-то неизвестные регулировщики по сигналу извне (добавление субстрата или индуктора) включали в работу гены, связанные с ферментами, и подавляли их активность при удалении субстрата или индуктора из клеточной среды.

Это было первым загадочным свойством, присущим системе синтеза: ферменты вырабатывались только по сигналу извне. Как же это происходит? И вторая загадка…

Среди многих соединений, усваиваемых бактериями, есть молочный сахар — лактоза. В его переработке участвуют два других вещества — галактозидпермеаза, регулирующая поступление сахара в клетку, и бэта-галактозидаза, расщепляющая его. После многих генетических опытов в хромосоме бактерий кишечной палочки удалось разыскать два гена, каждый из которых отвечает за синтез одного из этих ферментов. Удалось найти их взаимное расположение на хромосоме. Ну, а после этого, как и обычно, генетики начали изучать мутации, изменчивость этих двух генов, другими словами, стали исследовать, какие изменения в генах возникают и как они сказываются на работе клетки.

Как и полагалось по всем законам, один ген соответствовал одному ферменту и гены эти давали мутации.

Ученые обнаружили мутанты (то есть измененные гены), неспособные синтезировать пермеазу (их обозначили символом У). Затем нашли мутанты, неспособные синтезировать бэта-галактозидазу (их обозначили символом Z ). Затем выяснили, как часто возникают такие мутанты. Оказалось, что каждый из них встречается в среднем на 10 миллионов клеток бактерий кишечной палочки. Такая частота согласовывалась с теми числами, какие получались при исследовании других мутаций.

И вдруг среди этого благополучия прозвучал гром. Был обнаружен необычный мутант — его обозначили как 0°. Если он был в хромосоме бактерии, то она оказывалась неспособной синтезировать сразу оба фермента: и пермеазу и бэта-галактозидазу. Само по себе это еще не казалось чем-то чрезвычайным. Хотя и очень редко, но все же возникают мутанты, у которых повреждены сразу два гена. Их называют двойными. Но предположение о том, что 0° — двойная мутация, было тут же отброшено. Частота появления мутанта Y — Ю-7 и Z — также Ю-7. (Вспомните: одна мутация на 10 миллионов неизмененных генов.)

По законам теории вероятностей частота одновременного нарушения обоих генов должна быть равна Ю-14, то есть в десять миллионов раз меньше. Увы, нет! Частота возникновения мутации 0° была близка к 10—7. Значит, мутация 0° не является двойной. Но если так, то тогда она не может быть ничем иным, как самостоятельным изменением в хромосоме бактерии. И у нее должно быть свое, самостоятельное место: не в генах У и Z. Чтобы окончательно прояснить дело, теперь и следовало это место найти. Нужно было, скрещивая бактерии с разными изменениями в генах, определить расположение всех трех мутаций в хромосоме.

Несмотря на трудность такой работы, она удалась Ф. Жакобу и его сотрудникам. И оказалось: мутация 0° занимает свое, точно определенное место на хромосоме бактерий, неподалеку от генов У и Z. Так был найден особый ген 0 с весьма необычными качествами — его изменение выводило из строя еще два соседних гена. Это открытие только усугубляло трудность положения. Загадочность гена 0 теперь не подлежала сомнению: ген, оказывавший влияние на другие гены, регулирует их работу. Это было и ново и непонятно.

Не связаны ли две загадки между собой? Не являются ли они отражением единого процесса? За решение этих вопросов взялись Ж. Моно и Ф. Жакоб. Вероятно, предположили они, гены не одинаковы — одни дают информацию о синтезе ферментов и о составе — структуре каждого из них, а другие регулируют работу первых генов.

Значит, надо разделить все гены в хромосомах на две группы: гены, передающие информацию (их назвали структурными генами), и гены, регулирующие работу структурных генов (регуляторные гены). В нашем примере к структурным генам следовало отнести гены У и Z, а к регуляторным — ген 0. Исследователи пошли еще дальше — они предположили, что гены регуляторной системы состоят, в свою очередь, из двух, разновидностей: генов-регуляторов и генов-операторов.

Жакоб и Моно не ограничились простым делением генов регуляторной системы на два сорта. Они предложили и возможный механизм работы этих генов. Ген- регулятор управляет синтезом вещества, названного ими репрессором. Это первая стадия. На второй стадии репрессор перемещается от регулятора к гену-оператору. Подобно ключу от замка, репрессор может отпереть или запереть ген-оператор и в зависимости от этого запустить в ход или остановить «машину» структурных генов. Но репрессор может соединиться еще с одним веществом — индуктором. Тогда он потеряет свою активность и не сможет влиять на оператор.

Можно представить себе клетку как гигантский комбинат, где производятся самые разные белки. На комбинате множество узкоспециализированных цехов, занимающихся выпуском своей продукции. Один из них — наш лактозный цех по изготовлению бэта-галактозидазы и пермеазы. Если раньше считалось, что достаточно только два агрегата (два структурных гена: по одному на каждый фермент) и все будет в порядке, то теперь, по предложению Ф. Жакоба и Ж. Моно, работа цеха должна была выглядеть следующим образом. Вот ген-регулятор «штампует» молекулу репрессора. Этот репрессор подходит ко второму агрегату, гену-оператору, и, соединившись с ним, замыкает его. Оператор выключается, но вместе с ним выключаются и все структурные гены. С них перестает сниматься информация и выработка ферментов прекращается. Цех встал.

Но вот в комбинате потребовались бэта-галактозидаза и пермеаза. На территорию нашего цеха посылается индуктор. Его задача — дать команду: «включить лактозный цех». Индуктор «хватает» репрессор, оператор освобождается от контроля репрессора, включаются и снова начинают работать установки, изготавливающие ферменты. До тех пор, пока они нужны комбинату, в лактозный цех будут вновь и вновь поступать индукторы, связывающие молекулы репрессоров. И лишь когда потребность в лактозных ферментах исчезнет, репрессор снова замкнет оператор и цех перестанет работать. Такова была рабочая гипотеза двух французских исследователей. Она привлекала своей понятностью и объясняла многие загадочные вопросы. Теперь надо было доказать, что это не гипотеза, а настоящая теория, построенная на прочном фундаменте фактов.

Если схема Жакоба и Моно верна, то можно математически точно предсказать, что будет, если повредить ген-регулятор или ген-оператор. Если ген-регулятор реально существует, он, видимо, может давать два типа изменений. Первый — простая поломка, и тогда никакой контроль со стороны индукторов не повлияет на систему синтеза. Репрессор больше не производится (ведь ген-регулятор сломан), и ген-оператор заставит структурные гены работать непрерывно. Значит, если обнаружить бактерии с постоянным, нерегулируемым синтезом ферментов, это станет веским доказательством существования гена-регулятора.

Но можно предсказать и второй тип нарушений. Ведь ген-регулятор мог не сломаться, а просто измениться. Тогда изменится и репрессор, причем так, чтобы, потеряв возможность соединяться с индуктором, он продолжал бы воздействовать на ген-оператор. В этом случае синтез ферментов совсем остановится. Ведь индуктор не сможет освободить ген-оператор от репрессора: ключ останется в замке навсегда. Это первый участок предложенной французскими исследователями системы. А вместе с тем парность генов могла бы помочь решению теоремы Жакоба.

Можно представить себе и другой тип нарушения гена-оператора. К измененному гену нормальный репрессор перестанет подходить: переделанный замок нельзя запереть прежним ключом. Наступает нерегулируемый синтез, ведь теперь ничто не может выключить оператор.

Значит, теоретически возможны такие нарушения регуляторной системы: ген-регулятор может выйти из строя (и тогда клетка будет осуществлять нерегулируемый синтез ферментов). Либо он даст измененный репрессор (что замкнет синтез навсегда). Ген-оператор также может сломаться (и тогда синтез прекратится). Либо перестанет присоединять к себе репрессор (и синтезы будут идти нерегулируемо).

Но вот беда — несмотря на строгость логики этих рассуждений, проверить их на практике было пока невозможно. Допустим, найдется мутант с остановленным синтезом. За счет чего произошла остановка: измененного ли гена-регулятора или же испорченного гена-оператора? Определить это без дополнительных приемов исследования невозможно. Так ученые встали перед необходимостью введения новых методов работы.

О том, как микробы подковали… микроба

Чтобы разобраться в хитрости, примененной Жакобом и Моно, надо отметить основное отличие хромосом бактерий от хромосом клеток высших растений и животных. У последних все гены повторены дважды — они парны. Это приводит к интересным последствиям. Хотя оба парных гена отвечают за один признак, они могут отличаться друг от друга. Один изменен (мутантен), зато другой нормален; оба изменены; оба нормальны. Ничего этого нет у бактерий по той простой причине, что они имеют одинарную, а не двойную хромосому, и ни о каком взаимодействии парных генов в клетке бактерий не приходилось мечтать.

А вместе с тем парность генов могла бы помочь решению теоремы Жакоба и Моно. Помните, трудность, с которой столкнулись исследователи: было неясно, что явилось причиной одновременной остановки синтеза ферментов — поломка оператора или изменение молекулы репрессора (как следствие изменения гена-регулятора)? А теперь представьте себе, что удалось бы всунуть в одну клетку сразу и мутанный, и нормальный гены. Если мутация была следствием поломки оператора, то синтез ферментов теперь сразу восстановится и станет подчиняться контролю индуктора. Действительно, поломанный ген-оператор так и не будет работать, зато введенный в клетку сразу бы выявило место нарушения и истинного виновника аварии.

Ну, а если мутация затронула не оператор, а ген-регулятор? Он по-прежнему будет синтезировать измененные молекулы репрессоров, лишив их возможности связываться с индукторами. Помните, мы говорили, что такой репрессор, как поломанный ключ в замке, остался бы навсегда присоединенным к оператору.

В этом случае — вот оно, отличие! — введение нормального гена-оператора не сможет восстановить синтез. Второй, нормальный оператор, как и первый, окажется надежно заблокирован измененным репрессором. Как видите, введение второго гена в клетку сразу бы выявило место нарушения и истинного виновника аварии.

Осуществить такой опыт — объединить в одной клетке парные гены — помогла работа, выполненная Ф. Жакобом и Е. Адельбергом. Они научились временно создавать условия парности генов в бактериях: временно сливая нуклеиновые структуры двух микробов. Для нас сейчас важен только результат. Применив этот метод, Жакоб и Моно начали создавать различные модели парных генов и доказали, что происходят поломки и оператора, и регулятора, а отсюда следовал и основной вывод: ген-регулятор и ген-оператор реально существуют в хромосомах и они действительно регулируют белковые синтезы.

Когда были описаны признаки этих генов, Жакоб и Моно нашли для них и место на генетических картах хромосом. Гипотеза переросла в теорию.

Генетические причины рака

После работ Жакоба и Моно во многих лабораториях широко развернулось исследование регуляции белковых синтезов. Сейчас доказано, что большой класс реакций, совершающихся в различных организмах, начиная от бактерий и кончая млекопитающими, подчиняется схеме Жакоба и Моно. Видимо, такая регуляция биохимической активности клеток присуща всем организмам.

Исключительная важность этого открытия была быстро оценена. Оно сразу же было использовано для расшифровки внутриклеточных причин возникновения рака. В клетке, где нарушена регуляторная система пусть даже небольшого «белкового цеха», начинается лихорадочный синтез какого-то одного или небольшого числа ферментов. В расстройство затем приходит и весь уравновешенный комбинат белковых синтезов. А как раз это и наблюдается на практике. Было замечено, что многие виды рака — результат нерегулируемых синтезов в клетке.

И вот первое следствие из теории Жакоба и Моно. Возможно, что рак — следствие нарушения регуляторной системы генов. Но это все-таки предположение. А опыты?

В лаборатории Абелева изучалась биохимия раковых опухолей. Следя за развитием опухолей, ученые пытались обнаружить в них какие-то соединения, свойственные только им. Ведь если опухоль так резко отличается от окружающих нормальных тканей, то закономерно было искать и какие-то только ей присущие химические вещества. Поиски их увенчались успехом. В последнее время был описан белок альфа-глобулин, обнаруженный в опухоли печени мыши. Подобного ему не было ни в крови, ни в печени, ни в других органах здоровых взрослых мышей.

Когда исследователи начинали работу, только биохимия владела их помыслами. Но теперь они столкнулись с интересной генетической проблемой. Мы уже не раз говорили, что все синтезы в любых клетках идут под контролем генетических структур. Но раз так, то в ткани печени, которая перерастала в опухоль, должен был появиться новый ген, дающий информацию о новом глобулине.

Как доказать, что действительно появился новый ген? Прежде всего надо было установить, что нигде раньше в организме мыши не образовывалось такое соединение. Для этого ученые начали изучать мышей с самых первых моментов их развития, к своему удивлению в эмбрионах мышей они обнаружили тот же самый альфа-глобулин, который они посчитали результатом или, может быть, даже причиной злокачественного перерождения печеночной ткани.

Но — в этом решение проблемы! — такой глобулин образовывался в печени эмбриона только до тех пор, пока ткань печени росла. Росла! Как только рост остановился, иными словами, по достижении зрелого возраста, синтез альфа-глобулина прекращался. Сыграла свою роль регуляторная система клетки. По-видимому, репрессоры подавили деятельность структурных генов, ответственных за образование этого глобулина. Но ведь раковая опухоль — активно растущая ткань. И как только начался злокачественный рост, сразу же стал в ощутимых количествах образовываться глобулин, который и был найден учеными.

Что же сняло те репрессоры, которые есть в нормальной печени и подавляют в ней синтез альфа-глобулина?

Пока неизвестно, но ответ на этот вопрос был бы большим шагом вперед в изучении рака. Ценность теории Жакоба и Моно отнюдь не ограничивается только тем, что она помогает разобраться в проблеме рака. Сейчас нельзя еще даже предвидеть всех тех последствий, к которым приведут дальнейшие исследования по регуляции белковых синтезов.

Автор: В. Сойфер.