Як відбувається синтез білка

У кожній галузі науки є свій «синій птах»; кібернетики мріють про «думаючі» машини, фізики — про керовані термоядерні реакції, хіміки — про синтез «живої речовини» — білка. Синтез білка довгі роки був темою фантастичних романів, символом прийдешньої могутності хімії. Це пояснюється й тією величезною роллю, яка належить білку у світі живого, і тими труднощами, які неминуче поставали перед кожним сміливцем, який відважився «скласти» з окремих амінокислот вигадливу мозаїку білка. І навіть ще не самого білка, а тільки пептидів.

Різниця між білками і пептидами не тільки термінологічна, хоча молекулярні ланцюги і тих й інших складаються з амінокислотних залишків. На якомусь етапі кількість переходить у якість: пептидний ланцюг — первинна структура — набуває здатність згортатися в спіралі і клубки, утворюючи вторинну і третинну структури, характерні вже для живої матерії. І тоді пептид стає білком. Чіткої межі тут не існує — на полімерний ланцюг не можна поставити демаркаційний знак: до сюди — пептид, звідси — білок. Але відомо, наприклад, що адранокортикотропний гормон, що складається з 39 залишків амінокислот, — це поліпептид, а гормон інсулін, що складається з 51 залишку у вигляді двох кіл,— це вже білок. Найпростіший, але все ж білок.

Спосіб з’єднання амінокислот в пептиди був відкритий на початку минулого століття німецьким хіміком Емілем Фішером. Але ще довго після цього хіміки не могли серйозно думати не тільки про синтез білка або 39-членних пептидів, але навіть значно більш коротких ланцюгів.

Процес синтезу

Для того, щоб з’єднати між собою дві амінокислоти, треба подолати чимало труднощів. Кожна амінокислота, подібно двуликому Янусу, має два хімічних обличчя: карбоксильну кислотну групу на одному кінці і амінну основну групу — на іншому. Якщо від карбоксилу однієї амінокислоти відібрати групу ОН, а від аминої групи іншого — атом водню, то два амінокислотних залишку, що утворилися при цьому можуть з’єднатися один з одним пептидним зв’язком, і в результаті виникне найпростіший з пептидів — дипептид. І відщепиться молекула води. Повторюючи цю операцію, можна нарощувати довжину пептиду.

Проте цю, здавалося б, на перший погляд нескладну операцію практично важко втілити: амінокислоти дуже неохоче з’єднуються одна з одною. Доводиться їх активувати, хімічно, і «підігрівати» один з кінців ланцюга (найчастіше карбоксильний), і вести реакцію, суворо дотримуючись необхідних умов. Але це ще не все: друга складність полягає в тому, що з’єднуватися один з одним можуть не тільки залишки різних амінокислот, але і дві молекули однієї кислоти. При цьому будова синтезованого пептиду буде вже відрізнятися від бажаного. Більше того, кожна амінокислота може мати не дві, а кілька «ахіллесових п’ят» — бічних хімічно активних груп, здатних приєднувати амінокислотні залишки.

Щоб не дати реакції згорнути з заданого шляху, необхідно замаскувати ці помилкові мішені — «запечатати» на час проведення реакції всі реакційноздатні групи амінокислоти, крім однієї, приєднавши до них так звані захисні угруповання. Якщо цього не зробити, то мета буде рости не тільки з обох кінців, але і вбік, і амінокислоти вже не вдасться з’єднати в заданій послідовності. А адже саме в цьому і полягає сенс всякого спрямованого синтезу.

Але, позбавляючись таким чином від однієї неприємності, хіміки зіткнулися з іншою: захисні угруповання після закінчення синтезу потрібно видалити. У часи Фішера як «захист» застосовувалися угруповання, які відщеплялися гідролізом. Однак реакція гідролізу зазвичай виявлялася занадто сильним «потрясінням» для отриманого пептиду: з працею побудована його «конструкція» розвалювалася як тільки з неї знімали «будівельні ліси» — захисні угруповання. Лише в 1932 році учень Фішера М. Бергманн знайшов вихід з цього становища: він запропонував захищати аміногрупу амінокислоти карбобензоксигрупою, яку можна було видалити без пошкодження пептидного ланцюга.

Синтез з амінокислот

Протягом наступних років було запропоновано ряд так званих м’яких методів «зшивання» амінокислот одна з одною. Проте всі вони фактично були лише варіаціями на тему методу Фішера. Варіаціями, в яких іноді навіть важко було вловити вихідну мелодію. Але сам принцип залишався все тим же. І все тими ж залишалися труднощі, пов’язані із захистом вразливих груп. За подолання цих труднощів доводилося розплачуватися збільшенням числа стадій реакції: один елементарний акт з’єднання двох амінокислот — розпадався на чотири етапи. А кожна зайва стадія — це неминучі втрати.

Якщо навіть припустити, що кожна стадія йде з корисним виходом до 80% (а це хороший вихід), то через чотири етапи ці 80% «розтануть» до 40%. І це при синтезі тільки дипептида! А якщо амінокислот буде 8? А якщо 51, як в інсуліні? Додайте до цього труднощі, пов’язані з існуванням двох оптичних «дзеркальних» форм молекул амінокислот, з яких в реакції потрібна тільки одна, приплюсуйте проблеми відділення утворених пептидів від побічних продуктів, особливо в тих випадках, коли вони однаково розчиняються. Що ж вийде у сумі: Дорога в нікуди?

І все ж ці труднощі не зупиняли хіміків. Гонитва за «синім птахом» тривала. У 1954 році були синтезовані перші біологічно активні гормони-поліпептиди — вазопресин і окситоцин. У них було по вісім амінокислот. У 1963 році був синтезований 39-членний поліпептид АКТГ — адренокортикотропний гормон. Нарешті, хіміки США, Німеччини та Китаю синтезували перший білок — гормон інсулін.

Як же так, скаже читач, важка дорога, виявляється, призвела не в нікуди і не куди-небудь, а до здійснення мрії багатьох поколінь хіміків! Це ж епохальна подія! Вірно, це — епохальна подія. Але давайте тверезо оцінимо її, відмовившись від сенсаційності, знаків оклику і надмірних емоцій.

Ніхто не сперечається: синтез інсуліну — величезна перемога хіміків. Це колосальна, титанічна праця, гідна всілякого захоплення. Але разом з тим це, по суті, і стеля старої хімії поліпептидів. Це перемога на межі поразки.

Синтез та інсулін

В інсуліні 51 амінокислота. Щоб з’єднати їх в потрібній послідовності, хімікам знадобилося провести 223 реакції. Коли через три роки після початку першої з них була закінчена остання, вихід продукту становив менше однієї сотої відсотка. Три роки, 223 стадії, сота частка відсотка — погодьтеся, перемога носить чисто символічний характер. Говорити про практичне застосування цього методу дуже важко: занадто великі пов’язані з його реалізацією витрати. А адже в кінцевому рахунку мова йде про синтез не дорогоцінних реліквій слави органічної хімії, а про випуск життєво важливого лікарського препарату, який необхідний тисячам людей у всьому світі. Так класичний метод синтезу поліпептидів вичерпав себе на першому, самому простому білку. Значить, «синій птах» знову вислизнула з рук хіміків?

Новий метод синтезу

Приблизно за півтора року до того, як світ дізнався про синтез інсуліну, промайнуло ще одне повідомлення, яке спочатку не залучило особливої уваги: американський вчений Р. Мэрифілд запропонував новий метод синтезу пептидів. Оскільки сам автор спочатку не дав методу належної оцінки, і в ньому було багато недоробок, виглядав він у першому наближенні навіть гірше існуючих. Проте вже на початку 1964 року, коли Мэрифілду вдалося з допомогою свого методу здійснити повний синтез 9-членного гормону з корисним виходом в 70%, вчені здивувалися: 70% після всіх етапів — це 9% корисного виходу на кожній стадії синтезу.

Основна ідея нового методу полягає в тому, що зростаючі ланцюжки пептидів, які раніше були кинуті напризволяще хаотичного руху в розчині, тепер прив’язувалися одним кінцем до твердого носія — їх змушували стати на якір в розчині. Мэрифілд брав тверду смолу і до її активних груп «прив’язував» за карбонильний кінець першу амінокислоту, що збираються у пептид. Реакції йшли всередині окремих частинок смоли. У «лабіринтах» її молекул спочатку з’являлися перші короткі паростки майбутнього пептиду. Потім у посудину вводили другу амінокислоту, її молекули зшивалися своїми карбонильними кінцями з амінними кінцями «прив’язаною» амінокислотою, і в частинках виростав ще один «поверх» майбутньої «будівлі» пептиду. Так, етап за етапом, поступово нарощувався весь пептидний полімер.

Новий метод мав безперечні переваги: перш за все в ньому була вирішена проблема відділення непотрібних продуктів після приєднання кожної чергової амінокислоти — ці продукти легко змивалися, а пептид залишався пришитим до гранул смоли. Одночасно виключалася проблема розчинності зростаючих пептидів — один з головних проблем старого методу; раніше вони нерідко випадали в осад, практично перестаючи брати участь в процесі росту. Пептиди, що «знімалися» після закінчення синтезу з твердої підкладки, виходили майже всі однакового розміру і будови, у всякому разі, розкид у структурі був менше, ніж при класичному методі. І відповідно більше корисний вихід. Завдяки цьому методу синтез пептидів — копіткий, складний синтез — легко піддається автоматизації.

Мэрифілд спорудив нескладний автомат, який сам по заданій програмі проробляв всі належні операції — подачу реагентів, змішування, слив, промивання, відмер дози, додавання нової порції і так далі. Якщо за старим методом на приєднання однієї амінокислоти доводилося втрачати 2-3 дні, то Мэрифілд на своєму автоматі з’єднував за день 5 амінокислот. Різниця — в 15 разів.

У чому полягають труднощі синтезу

Метод Мэрифілда, названий твердофазним, або гетерогенним, відразу ж був прийнятий на озброєння хіміками всього світу. Проте вже через короткий час стало ясно: новий метод разом з великими перевагами має і ряд серйозних недоліків.

По мірі зростання пептидних ланцюгів може статися так, що в якомусь з них виявиться пропущеним, скажімо, третій «поверх» — третя за рахунком амінокислота: її молекула не дійде до місця з’єднання, застрягши десь по дорозі в структурних «нетрях» твердого полімеру. І тоді, навіть якщо всі інші амінокислоти, починаючи з четвертої, вишикуються в належному порядку, це вже не врятує положення. Отриманий поліпептид за своїм складом, а отже, і за своїми властивостями не буде мати нічого спільного з одержуваною речовиною. Відбудеться те ж саме, що і при наборі телефонного номера; варто пропустити одну цифру — і нам вже не допоможе той факт, що всі інші ми набрали правильно. Відокремити такі ж неправдиві ланцюги від «справжніх» практично неможливо, і препарат виявляється засміченим домішками. Крім того, виявляється, що синтез не можна вести на якій завгодно смолі — її потрібно ретельно підбирати, так як властивості зростаючого пептиду залежать певною мірою від властивостей смоли. Тому до всіх етапів синтезу білка необхідно підходити максимально ретельно.

Автор: В. Азеринков.